微生物限度檢驗方法驗證方案
◆適用范圍
本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。
◆目的
通過驗證確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定 。
◆職責
項目責任人：負責驗證方案的起草及具體實施。
驗證管理員：負責驗證工作的組織、協調及管理。
QA現場監控員：負責驗證實施過程中的監督檢查，取樣，確保結果的可靠性。
QC負責人：負責驗證方案中檢驗方法的審核及按照規定的取樣計劃對標準檢驗操作程序的準確執行，負責組織實施。
QC檢驗員：負責驗證方案的起草與參與實施，并對所測數據準確性負責。
質量部經理：負責驗證方案及報告的審核和批準。
1.內容
1.1.概述
通過驗證以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定；確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據驗證結果判斷是否符合驗證標準。若符合，按驗證的方法和條件進行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進行驗證，直至驗證結果符合設立的驗證標準。
1.2.細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證
當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數同時進行。
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1.2.1.驗證用菌株及菌種要求
大腸埃希菌【CMCC（B）44102】
金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】
枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】
黑曲霉【CMCC（F）98003】
白色念珠菌【CMCC（F）98001】
大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產芽孢桿菌，前述菌株作為細菌計數驗證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母菌計數驗證用菌株。
驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。
1.2.2.驗證菌菌液制備
1.2.2.1. 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至10ml營養瓊脂培養基中，35～37℃ 培養18～24小時。取此培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數 50～100cfu的菌懸液。
1.2.2.2.白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養 24～48小時；取此培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數 50～100cfu的菌懸液。
1.2.2.3.接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，23～28℃培養5～7天，加入3～5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內，取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，制成每1ml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。
1.2.3. 供試液的制備
1.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的制備
◆稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液
◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。
◆固體、半固體、粘稠性供試品供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。
1.2.3.2.具有抑菌活性的供試品供試液的制備
當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：
◆ 培養基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養基，測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數，混勻，凝固，培養。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數之和即為1ml的菌落數。計算每1ml供試液的平均菌落數， 按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。
◆離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。
◆薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數。
◆ 中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當的對氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養基內加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸 80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。
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1.2.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數。采用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。
1.2.5.試驗組
1.2.5.1.平皿法：取試驗可能用的稀釋級1ml供試液和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。
1.2.5.2.培養基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。
1.2.5.3薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數。至少要一張膜。
1.2.5.4. 離心沉淀集菌法：取規定量試驗可能用的稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉/分離心 20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數。
1.2.6. 供試品對照組
取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數（方法和試驗組相同）。
1.2.7.稀釋劑對照組
若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和計數方法計數。
1.2.8.回收率計算
1.2.8.1.試驗組回收率計算
試驗組的菌回收率＝ 試驗組的菌回收率—供試品對照組平均菌落數 ×100%
菌液組的平均菌落數
1.2.8.2. 稀釋劑對照組回收率計算
試驗組的菌回收率＝ 稀釋劑對照組平均菌落數 ×100%
菌液組的平均菌落數
計數方法驗證至少應進行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
1.2.8.3. 結果判斷
在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）≥70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70%。
1.3. 控制菌檢驗方法驗證
當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢驗方法應進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。
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1.3.1.驗證用菌株
大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】
驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。
1.3.2.菌液制備
大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯培養基中，35～37℃培養18～24小時；分別取培養液 1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，制成每1ml含菌數10～100cfu的菌懸液。
1.3.3. 陰性菌對照組 設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。
1.3.4.試驗組
1.3.4.1.常規法
◆ 大腸埃希菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養18～24小時，取此培養物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項下規定檢查。
◆大腸菌群 取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發酵培養基管3支，分別加入含供試品1g或1ml 、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養18～24小時，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項下規定檢查。
◆沙門菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養肉湯培養基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌 10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。
◆銅綠假單胞菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。
◆ 金黃色葡萄球菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規定檢查。
1.3.4.2. 培養基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強的樣品。
1.3.4.3. 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養基或取出濾膜接入增菌培養基中。
1.3.4.4. 離心沉淀集菌法 取規定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養，本法適用于中度抑菌作用的樣品。
1.3.4.5.中和法 在供試品溶液中加入相應的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應對微生物無毒性，與抑菌成分結合后的產物應對微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。
1.3.5.結果判斷
至少應進行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進行該供試品控制菌的檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。
2.驗證的實施
2.1細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證記錄及控制菌檢驗方法驗證記錄(見附件)。
2.2.分析數據，綜合整個驗證過程，得出驗證結論。
2.3.驗證過程中發生的異常情況，按照《偏差處理程序》進行處理。
3.相關文件
《微生物限度檢查SOP》
4.再驗證
4.1.藥品的組分發生改變可能影響檢驗結果時。
4.2.驗證時檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時。
